Расшифрована структура комплекса I дыхательной цепи митохондрий быка

Расшифрована структура комплекса I дыхательной цепи митохондрий быка

В недавнем выпуске журнала Nature группа ученых из Великобритании и Китая опубликовала статью с расшифровкой структуры комплекса I (NADH-дегидрогеназный комплекс) электрон-транспортной цепи митохондрий быка Bos taurus методом крио-электронной микроскопии. Работа развивает результаты этой группы, полученные в 2014 году, когда ученым удалось разобраться в общих чертах, как устроена структура этого комплекса. Новое исследование предоставляет новые данные о функционировании и сборке NADH-дегидрогеназы, а также информацию, по которой можно судить о роли мутаций в развитии связанных с ней наследственных заболеваний.

На клеточном уровне дыхание — это сложная последовательность окислительно-восстановительных реакций, в результате которой клетка запасает энергию в виде молекул АТФ, которые называют универсальной энергетической валютой клеток. Этот процесс обеспечивается дыхательной цепью переноса электронов — системой из нескольких белковых комплексов, которые располагаются в клеточной мембране (схематично изображены на рис. 1, также работа цепи показана на этой анимации).

Первый в этой цепи — NADH-дегидрогеназный комплекс (его так и называют — комплекс I). У эукариот он функционирует в митохондриях, но также встречается и у способных к дыханию прокариот. Этот комплекс осуществляет реакцию окисления NADH, сопряженную с восстановлением убихинона. При этом происходит перенос четырех протонов из матрикса митохондрии или цитоплазмы прокариот наружу в ходе следующей реакции:

[ mathrm{NADH} + mathrm{H}^+ + mathrm{Q} + 4mathrm{H}^+_{mathrm{in}} rightarrow mathrm{NAD}^+ +mathrm{QH}_2 + 4mathrm{H}^+_{mathrm{out}}. ]

В ходе этой окислительно-восстановительной реакций, катализируемой NADH-дегидрогеназным комплексом, NADH окисляется до NAD+, что сопряжено с восстановлением убихинона (Q) до убихинола (QH2). Энергия реакции используется для транспорта протонов из матрикса митохондрий (H+in) наружу (H+out).

И именно шаг транспорта протонов вызывает у ученых больше всего вопросов.

Дальнейшая работа дыхательной цепи устроена так. Восстановленный до убихинола убихинон транспортируется к следующему участку — цитохром-bc1-комплексу, где окисляется и передает свои электроны цитохрому с. Восстановленный цитохром с, в свою очередь, окисляется очередным участком цепи — цитохром с-оксидазой. В случае кислородного дыхания, этот последний комплекс завершает путешествие электронов по дыхательной цепи, восстанавливая ими кислород до воды.

Целью всей этой эстафеты по передаче электронов от NADH кислороду является аккуратное расходование энергии, запасенной в реакции их прямого взаимодействия. На каждом ферментативном комплексе дыхательной цепи энергия, выделяющаяся в ходе окислительно-восстановительных реакций (передача электронов), идет на транспорт протонов из матрикса митохондрий (цитоплазмы прокариот) наружу. Этот процесс помогает формировать трансмембранный протонный потенциал, который используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ. На долю NADH-дегидрогеназного комплекса приходится порядка 40% работы по созданию трансмембранного потенциала.

В последние несколько лет разными группами ученых уже были изучены структуры комплекса I из бактерии Thermus thermophilus, дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica и быка (рис. 2). Исследования бычьего варианта комплекса I важно, поскольку он близок к гомологичному ферменту человека. Но в 2014 году ученым (авторам и обсуждаемой работы) не удалось полностью расшифровать структуру — были получены данные только для 28 субъединиц из 45.

Расшифрована структура комплекса I дыхательной цепи митохондрий быка

Такой интерес к NADH-дегидрогеназному комплексу вызван загадками в механизме его функционирования, а также клинической значимостью ассоциированных с ним заболеваний. С нарушениями в функционировании первого дыхательного комплекса связаны некоторые митохондриальные заболевания: например, синдром Лея и оптическая нейропатия Лебера. Кроме того, по последним исследованиям, существует связь между дефектами NADH-дегидрогеназы и развитием болезни Паркинсона. Поэтому детальное изучение фермента может позволить глубже разобраться в причинах заболеваний и подсказать пути к их лечению.

Сейчас ученые получили полную структуру комплекса I — удалось расшифровать все 45 субъединиц, входящих в его состав. При этом 14 субъединиц образуют консервативное ядро, сохраняющееся в структурах гомологичного фермента бактерий и грибов, а 31 субъединица специфична для млекопитающих. Комплекс имеет характерную L-образную форму — вертикально расположенная часть комплекса содержит сайты связывания NADH и убихинона и выдается в матрикс митохондрии. Горизонтальная часть заякорена во внутренней мембране митохондрии и является протонной помпой — именно она переносит протоны из матрикса в межмембранное пространство. Сайт связывания NADH расположен в дистальном отделе матриксной части комплекса. Ближе к мембранной части локализуется сайт связывания убихинона.

Два этих сайта соединены цепочкой из специальных кофакторов — железосерных кластеров (рис. 3), способных менять степень окисления. По этой цепочке происходит передача электронов между NADH и убихиноном. Предполагается, что перераспределение отрицательных зарядов, возникающее при восстановлении убихинона, вызывает небольшие изменения в структуре комплекса (конформационные перестройки), которые передаются в его мембранную часть. Это, по всей видимости, приводит к поляризации местных заряженных аминокислотных остатков, которые формируют для протонов трансмембранные каналы, что и обеспечивает перенос частиц. Косвенные данные в пользу гипотезы присутствуют в описываемой работе — исследователям удалось получить несколько «подструктур», которые можно трактовать как активное и не активное состояния комплекса. Это стало возможным благодаря используемому ими методу крио-электронной микроскопии (см. Cryo-electron microscopy).

Суть метода заключается в том, чтобы сфотографировать в электронный микроскоп интересующую нас молекулу с разных ракурсов, а потом реконструировать ее пространственную структуру. Но одной молекулы для такой операции недостаточно. Вместо этого на специальную ячеистую подложку наносят раствор молекул, а затем мгновенно замораживают его в жидком этане. Получается, что часть частиц застыла «в профиль», часть — «в анфас», а некоторые — «в 3/4». Фотографируя подложку в электронном микроскопе, мы получаем многие десятки или даже сотни тысяч изображений молекулы с разных сторон. Последующая компьютерная классификация изображений («в профиль» отдельно, «в анфас» отдельно) и их выравнивание позволяет значительно снизить уровень шума и достичь атомарного разрешения, после чего проводится сборка пространственной структуры молекулы.

На момент замораживания интересующая нас молекула может находиться в разных конформационных состояниях (если это фермент, то на разных стадиях каталитического цикла, например) и все они будут мгновенно зафиксированы. При автоматическом анализе изображений возможно отличать такие состояния и реконструировать не одну конформацию, как в случае рентгеноструктурного анализа, а несколько, что может пролить свет на детали функционирования комплекса.

Как заключают авторы статьи, именно этот подход (изучение конформационных изменений посредством крио-электронной микроскопии) является наиболее перспективным для дальнейшего изучения комплекса I дыхательной цепи и проверки существующих гипотез о роли промежуточных продуктов восстановления убихинона в механизме функционирования фермента.